一、技術(shù)原理

在植物科學的研究中，解析轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作機制，是構(gòu)建基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的ChIP-seq技術(shù)依賴高質(zhì)量特異性抗體，這一局限性使非模式植物的研究面臨巨大挑戰(zhàn)。DAP-seq（DNA Affinity Purification Sequencing，DNA親和純化測序）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究模式和非模式植物基因表達調(diào)控機制，提供了高效解決方案。DAP-seq的原理是通過體外表達出含有標簽（如His、Halo標簽）的目的蛋白，并將其與標簽特異性配體結(jié)合，然后富集DNA，使用高通量測序與生物信息學分析，在全基因組范圍內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點（TFBS）。該技術(shù)無需目的蛋白特異性抗體，無需轉(zhuǎn)基因材料，即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)，已成為植物學、微生物學等領(lǐng)域解析基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵技術(shù)手段。

藍景科信DAP-seq技術(shù)路線圖

二、技術(shù)優(yōu)勢

1. 不依賴目的蛋白特異性抗體

無需目標蛋白特異性抗體，僅需標簽配體，即可完成對DNA的富集，尤其適合缺乏抗體的非模式生物。

2. 無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料

通過體外表達系統(tǒng)高效生產(chǎn)目的蛋白，解除了內(nèi)源蛋白表達量低、組織特異性表達或其他因子干擾的限制。

3. 適用于不同物種

藍景科信已將DAP-seq成功應用于200多個物種，涵蓋植物、動物、真菌及細菌。實驗流程可根據(jù)物種特性靈活優(yōu)化。

4. 雙DNA親和純化測序（dDAP-seq）技術(shù)

能夠在體內(nèi)基因組背景下繪制相互作用轉(zhuǎn)錄因子（二聚體）的全基因組結(jié)合位點，為研究轉(zhuǎn)錄因子相互作用如何調(diào)節(jié)結(jié)合特異性、潛在靶基因和生物學功能提供了有力工具。

三、技術(shù)發(fā)展與影響力

自2016年DAP-seq在《Cell》發(fā)表，2017年實驗方法在《Nature Protocols》正式發(fā)布后，DAP-seq迅速成為解析轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機制的關(guān)鍵技術(shù)。截至目前，藍景科信使用該技術(shù)，已助力科學家在植物生長發(fā)育、逆境脅迫響應、果實發(fā)育、系統(tǒng)進化等多個研究方向取得突破，相關(guān)研究成果發(fā)表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等期刊。

四、藍景科信實戰(zhàn)案例：DAP-seq在高分文章中的應用

應用場景一：解析植物生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

案例1：DAP-seq助力解析擬南芥WRKY1轉(zhuǎn)錄因子促進一次結(jié)實衰老的分子機制

發(fā)表時間：2024年7月

期刊：Cell（IF=17.1）

題目：Arabidopsis WRKY1 promotes monocarpic senescence by integrative regulation of flowering, leaf senescence and nitrogen remobilization

研究背景：

一次結(jié)實衰老在種子植物中普遍存在，影響作物收獲時間和品質(zhì)，但外界和內(nèi)部信號如何系統(tǒng)性整合調(diào)控該過程的機制尚不明確，尤其是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在其中的作用有待探究。

主要結(jié)果：

研究發(fā)現(xiàn)，WRKY1的表達受年齡、水楊酸（SA）和氮缺乏誘導，其過表達株系（WRKY1-OE）表現(xiàn)為開花提前和葉片早衰，而wrky1突變體則延遲開花和衰老。通過DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，鑒定出WRKY1的直接靶基因：

1. 開花調(diào)控：WRKY1直接結(jié)合開花抑制基因FLC的啟動子（如W1-W3位點），抑制其表達，從而激活FT和SOC1，促進開花轉(zhuǎn)換。 

2. 葉片衰老調(diào)控：WRKY1靶向SA生物合成基因SID2和PBS3的啟動子（如SID2的W2/W4、PBS3的W1-W3位點），激活SA合成，加速葉片衰老。 

3. 氮素再分配調(diào)控：WRKY1結(jié)合氮同化基因NIA1、NRT3.1等的啟動子，增強硝酸鹽還原酶和轉(zhuǎn)運蛋白的表達，促進氮從衰老葉片向種子的再分配。 

本文通過DAP-Seq在全基因組范圍內(nèi)鑒定出擬南芥WRKY1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點以及保守結(jié)合基序，系統(tǒng)性揭示了WRKY1在單稔衰老中的靶基因網(wǎng)絡(luò)，特別是其對SA生物合成、氮代謝和FLC開花通路的直接調(diào)控。這些結(jié)果通過ChIP-qPCR、EMSA、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱斑z傳分析等多維度驗證，形成了“結(jié)合預測-分子互作-功能表型"的完整證據(jù)鏈，為闡明WRKY1調(diào)控單次結(jié)實衰老機制提供了關(guān)鍵依據(jù)。

案例2：DAP-seq助力揭示葉綠體生物發(fā)生的調(diào)控機制

發(fā)表時間：2024年7月

期刊：Cell（IF=45.5）

題目：MYB-related transcription factors control chloroplast biogenesis

研究背景：

葉綠體生物發(fā)生對植物光合作用至關(guān)重要，已知GLK家族轉(zhuǎn)錄因子是主要調(diào)控因子，但其單基因突變體仍有殘留葉綠素，暗示存在其他協(xié)同調(diào)控因子，而MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在葉綠體發(fā)育中的作用及其與GLK的互作機制尚不明確。

主要結(jié)果：

已知GLK是葉綠體發(fā)育的主調(diào)控因子，但GLK突變體仍有殘留葉綠素，DAP-Seq證明MYB相關(guān)因子通過直接調(diào)控光合系統(tǒng)組裝和碳代謝基因，彌補了GLK缺失的功能，揭示了葉綠體發(fā)育的雙重調(diào)控機制。

本文通過DAP-Seq在全基因組范圍內(nèi)鑒定了地錢（Marchantia polymorpha）中MYB相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子MpRR-MYB2和MpRR-MYB5的結(jié)合位點，結(jié)果顯示二者分別有6,804個和2,839個結(jié)合峰，43%（MpRR-MYB2）和35%（MpRR-MYB5）位于啟動子區(qū)域，且共享保守基序TTATC。靶基因功能富集于葉綠素生物合成、光合系統(tǒng)組裝、碳固定和光呼吸通路，且與GLK調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在協(xié)同互作（如MpGLK啟動子含MYB結(jié)合位點）。這一結(jié)果系統(tǒng)性揭示了MYB因子在葉綠體發(fā)育中的直接調(diào)控作用，彌補了GLK調(diào)控的空白，是解析葉綠體雙重調(diào)控機制的關(guān)鍵，為構(gòu)建“MYB-GLK協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)"提供了分子證據(jù)。隨后通過ChIP-qPCR證實體內(nèi)結(jié)合，酵母單雜交和雙熒光素酶報告實驗驗證直接互作，地錢和擬南芥雙突變體表型及跨物種互補實驗進一步確認功能保守性。

應用場景二：揭示植物脅迫響應機制

案例3：DAP-seq助力揭示提升棉花耐鎘能力的新機制

發(fā)表時間：2024年1月

期刊：Plant Biotechnology Journal（IF=13.8）

題目：GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1 transcriptional cascade

研究背景：

鎘是常見有害重金屬，威脅作物與食品安全，易被植物吸收進入食物鏈。植物修復是有效治理途徑，棉花作為非食用經(jīng)濟作物，修復土壤鎘污染具天然優(yōu)勢，可避免鎘進入食物鏈，探究其響應鎘脅迫的調(diào)控機制意義重大。

主要結(jié)果：

本文揭示了棉花中GhRCD1通過調(diào)控GhbHLH12–GhMYB44–GhHMA1轉(zhuǎn)錄級聯(lián)增強鎘（Cd2?）耐受性的分子機制。其中通過DAP-Seq在全基因組范圍鑒定了GhMYB44的靶基因網(wǎng)絡(luò)，尤其是重金屬轉(zhuǎn)運基因GhHMA1/5的直接調(diào)控關(guān)系。結(jié)合Y1H、EMSA、雙熒光素酶報告實驗和遺傳實驗，證實了GhMYB44通過G-box元件激活GhHMA1轉(zhuǎn)錄，并與ABA信號通路協(xié)同調(diào)控棉花Cd2?耐受。DAP-Seq數(shù)據(jù)為解析GhMYB44在Cd2?耐受中的作用提供了分子基礎(chǔ)，補充棉花重金屬轉(zhuǎn)運調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的空白。

案例4：DAP-seq助力解析大麥HvbZIP87基因提高小麥抗病高產(chǎn)的新機制

發(fā)表時間：2025年5月

期刊：Journal of Advanced Research（IF=11.4）

題目：Heterologous expression of the barley-specific HvbZIP87 transcription factor in wheat enhances broad-spectrum disease resistance with balanced yield

研究背景：

小麥和大麥等禾本科作物的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）分子機制尚不明確，尤其是NPR1與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的互作網(wǎng)絡(luò)在抗病中的作用需進一步探究，且開發(fā)新的廣譜抗病基因?qū)π←溈共∮N具有重要意義。

主要結(jié)果：

基于HvNPR1大麥轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、系統(tǒng)發(fā)育分析及核定位特征，鎖定HvbZIP87為大麥特異性SAR相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。隨后進行DAP-seq實驗，結(jié)果顯示HvbZIP87直接調(diào)控PR基因和鋅轉(zhuǎn)運相關(guān)基因（如TaZIP5、TaZIP9），保守結(jié)合基序為“TGACGTCATCATG"。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，證實其在無病原物條件下即可激活PR基因表達，觸發(fā)系統(tǒng)性獲得抗性（SAR）。DAP-seq系統(tǒng)性揭示了HvbZIP87在小麥基因組中的結(jié)合靶點，明確其通過順式元件直接激活PR基因和鋅轉(zhuǎn)運基因，而非依賴病原菌誘導，揭示了其調(diào)控小麥抗病性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為功能驗證提供了直接依據(jù)。

應用場景三：挖掘植物品質(zhì)形成機制

案例5：DAP-seq技術(shù)助力挖掘水稻香氣形成的關(guān)鍵調(diào)控因子

發(fā)表時間：2024年11月

期刊：Molecular Plant（IF=17.1）

題目：Volatilome-based GWAS identifies OsWRKY19 and OsNAC021 as key regulators of

rice aroma

研究背景：

香米因其的香味而受到全球的青睞，盡管2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）是水稻香氣的主要成分，但除2-AP外水稻香氣的代謝基礎(chǔ)及香氣代謝物積累的遺傳機制（除OsBADH2和OsODC外）尚未明確，解析水稻香氣的分子調(diào)控機制對香稻品種培育具有重要意義。

主要結(jié)果：

本文通過揮發(fā)組全基因組關(guān)聯(lián)研究（vGWAS）結(jié)合分子生物學技術(shù)，鑒定到兩個調(diào)控水稻香氣的關(guān)鍵基因：OsWRKY19和OsNAC021。OsWRKY19通過DAP-seq以及ChIP-qPCR、EMSA、雙熒光素酶報告實驗被證實直接結(jié)合OsBADH2啟動子的W-box元件（TTGACC/T），抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進2-AP積累；OsNAC021則通過結(jié)合脂氧合酶（LOX）通路基因（如OsADH1、OsADH2、OsLOX9）啟動子的NACRS元件，負調(diào)控FAVs合成。最終揭示了水稻香氣調(diào)控的雙轉(zhuǎn)錄因子模塊及其機制。DAP-seq實驗為解析OsWRKY19調(diào)控水稻香氣代謝及農(nóng)藝性狀的分子機制提供了直接證據(jù)。

案例6：DAP-seq助力揭示軟棗獼猴桃果實變色機制

發(fā)表時間：2025年4月

期刊：Molecular Horticulture（IF=10.6）

題目：Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin

regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)

研究背景：

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）因果實富含花青素而受市場歡迎，但其花青素合成的分子調(diào)控機制尚不明確，且缺乏紅色品種的染色體級基因組，限制了相關(guān)基因挖掘和分子育種研究。

主要結(jié)果：

本文通過染色體水平的軟棗獼猴桃品種‘天元紅’基因組組裝（N50=21 Mb）及比較基因組分析，結(jié)合RNA-seq篩選到負調(diào)控花青素合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AaBEE1。利用DAP-seq在軟棗獼猴桃中鑒定出AaBEE1的457個高置信度結(jié)合峰，主要分布于轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 kb內(nèi)的啟動子區(qū)域，保守結(jié)合基序為G-box（CACGTG），靶基因顯著富集于類黃酮生物合成通路，其中直接靶向花青素合成關(guān)鍵基因AaLDOX啟動子的G-box元件。通過酵母單雜交（Y1H）、電泳遷移率變動分析（EMSA）、染色質(zhì)免疫共沉淀PCR（ChIP-qPCR）和雙熒光素酶報告系統(tǒng)（LUC）驗證其直接抑制AaLDOX表達。此外，AaLDOX啟動子區(qū)29 bp插入/缺失（Indel）變異與果實顏色高度關(guān)聯(lián)，攜帶插入變異的紅色品種中AaLDOX啟動子活性更高，而缺失變異的綠色品種中AaBEE1結(jié)合增強，抑制基因表達。本研究構(gòu)建了“AaBEE1-AaLDOX"調(diào)控模塊，DAP-seq是解析AaBEE1調(diào)控機制的核心技術(shù)，為揭示了軟棗獼猴桃花青素合成的分子機制提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

藍景科信：提供DAP-seq技術(shù)服務的優(yōu)質(zhì)合作伙伴

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