文章名稱：Double DAP-seq uncovered synergistic DNA binding of interacting bZIP transcription factors

期刊：Nature communications

發(fā)表時(shí)間：2023年5月5日

一、研究背景

轉(zhuǎn)錄因子（TF）相互作用對(duì)基因表達(dá)的組合調(diào)控至關(guān)重要，bZIP轉(zhuǎn)錄因子的二聚化對(duì)其功能發(fā)揮意義重大，但同源和異源二聚體在DNA結(jié)合和功能特異性方面的分子機(jī)制尚不清楚。此前研究多使用合成寡核苷酸，無(wú)法充分體現(xiàn)基因組的序列多樣性和結(jié)合位點(diǎn)背景。為深入探究TF相互作用如何影響DNA結(jié)合特異性，本文開(kāi)發(fā)了雙DNA親和純化測(cè)序（dDAP-seq）技術(shù)，以研究擬南芥中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的二聚體結(jié)合位點(diǎn)。

二、dDAP-seq技術(shù)原理

dDAP-seq是在DAP-seq基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)。在dDAP-seq中，同時(shí)體外表達(dá)兩個(gè)分別融合不同親和標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄因子，即SBPTag-TF1和HaloTag-TF2，且使SBPTag-TF1表達(dá)量更高，促使HaloTag-TF2與之形成異源二聚體。將表達(dá)的蛋白與片段化的基因組DNA孵育后，利用HaloTag配體偶聯(lián)的磁珠特異性捕獲含有HaloTag-TF2的蛋白或蛋白復(fù)合物及其結(jié)合的DNA片段，隨后對(duì)回收的DNA進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)這種方法，能夠在全基因組范圍內(nèi)定位相互作用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。

三、研究思路

1. 技術(shù)開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證

鑒于單獨(dú)使用DAP-seq無(wú)法檢測(cè)到擬南芥C bZIP的DNA結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)C組與S1組bZIP形成異源二聚體可能增加DNA結(jié)合能力，從而開(kāi)發(fā)dDAP-seq技術(shù)。利用該技術(shù)對(duì)20對(duì)C/S1 bZIP異源二聚體和S1同源二聚體進(jìn)行全基因組結(jié)合位點(diǎn)分析，并通過(guò)多種方法驗(yàn)證dDAP-seq數(shù)據(jù)的可靠性。

2. 結(jié)合位點(diǎn)特征分析

研究C/S1二聚體在不同組織和發(fā)育階段的共表達(dá)模式，分析其全基因組結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)性和序列基序，探究異源二聚體與同源二聚體DNA結(jié)合偏好的差異，以及這些差異與二聚體功能特異性的關(guān)系。

3. 功能驗(yàn)證

將dDAP-seq鑒定的S1:C異源二聚體結(jié)合事件與RNA-seq數(shù)據(jù)相結(jié)合，分析差異表達(dá)基因，確定二聚體結(jié)合與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系。通過(guò)GO富集分析，探究C/S1二聚體潛在的生物學(xué)功能。針對(duì)bZIP9和bZIP53這兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，深入研究其異源二聚體的功能和DNA結(jié)合特異性。

四、研究結(jié)果

1. dDAP-seq鑒定bZIP C/S1異源二聚體結(jié)合位點(diǎn)

dDAP-seq成功檢測(cè)到S1:C異源二聚體的大量結(jié)合位點(diǎn)，而單獨(dú)使用DAP-seq時(shí)C bZIP無(wú)顯著峰值富集。數(shù)據(jù)顯示，S1:C異源二聚體的結(jié)合位點(diǎn)與S1同源二聚體及其他bZIP組的結(jié)合位點(diǎn)存在顯著差異，許多異源二聚體的結(jié)合位點(diǎn)是不同的，表明C和S1 bZIP可能具有協(xié)同功能。

圖1 通過(guò)DAP-seq和dDAP-seq系統(tǒng)鑒定bZIP C/S1 bZIP同源二聚體和異源二聚體的結(jié)合位點(diǎn)。

2. C/S1 bZIP二聚體全基因組結(jié)合特征

通過(guò)S1和C基因的共表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)S1和C基因在多個(gè)組織和發(fā)育階段共表達(dá)，這表明不同S1:C異源二聚體可能在多個(gè)組織中形成。這就增加了不同 S1:C 異源二聚體對(duì)功能冗余的可能性，同時(shí)也表明僅靠表達(dá)模式來(lái)了解它們之間的功能差異是有限的。隨后通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，異源二聚體（S1組與C組結(jié)合）改變了S1組bZIP的DNA結(jié)合偏好，不同的異源二聚體具有不同的二級(jí)基序富集模式，這些模式與全基因組結(jié)合相關(guān)性聚類(lèi)結(jié)果相符。

圖2 C/S1 bZIP二聚體全基因組結(jié)合相關(guān)性及DNA序列基序概述。

3. dDAP-seq揭示二聚體調(diào)控的基因表達(dá)

為了確定dDAP-seq鑒定出的S1:C異源二聚體結(jié)合事件是否能夠調(diào)控基因表達(dá)，作者比較了DAP-seq，dDAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)S1和S1:C二聚體的預(yù)測(cè)靶基因在bzipS1突變體的下調(diào)差異表達(dá)基因中顯著富集，表明DAP-seq或dDAP-seq預(yù)測(cè)的C/S1二聚體靶基因在植物體內(nèi)受S1 bZIP轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對(duì)bZIP1靶基因的分析顯示，dDAP-seq在其近端啟動(dòng)子區(qū)域有強(qiáng)烈的讀數(shù)富集，且在瞬時(shí)靶基因上的結(jié)合信號(hào)更強(qiáng)，說(shuō)明這些靶基因可能也受含bZIP1的S1:C異源二聚體調(diào)控。

圖3 dDAP-seq鑒定C/S1 bZIP轉(zhuǎn)錄因子的直接靶基因及其潛在的功能。

4. C/S1二聚體靶基因的功能富集分析

GO富集分析表明，S1和S1:C二聚體的靶基因在響應(yīng)非生物脅迫、光、碳水化合物代謝過(guò)程等生物過(guò)程中顯著富集。部分異源二聚體的靶基因與缺氧響應(yīng)相關(guān)，這與C/S1 bZIP在種子發(fā)育中的重要作用相關(guān)。此外，不同二聚體的靶基因在響應(yīng)茉莉酸、水楊酸等激素以及信號(hào)調(diào)節(jié)等方面存在差異，體現(xiàn)了異源二聚體DNA結(jié)合導(dǎo)致的功能多樣性（圖3 c）。

5.  bZIP9異源二聚體靶基因分析揭示其在ABA響應(yīng)中的功能

由于異源二聚體對(duì)DNA結(jié)合很重要，C bZIPs的直接靶基因表征有限，而且由于CbZIPs成員之間存在高度冗余，研究其生物學(xué)功能具有挑戰(zhàn)性。作者假設(shè)S1:C bZIPs的dDAP-seq結(jié)果可以幫助揭示C bZIPs的功能，并選擇通過(guò)聚焦于bZIP9來(lái)探索這一假設(shè)。

對(duì)bZIP9異源二聚體靶基因的GO分析發(fā)現(xiàn)，其顯著富集在響應(yīng)脫落酸（ABA）等生物學(xué)過(guò)程。bZIP9異源二聚體在ABA響應(yīng)標(biāo)記基因RD29A和RD29B的啟動(dòng)子區(qū)域有強(qiáng)烈結(jié)合信號(hào)，且共轉(zhuǎn)染bZIP9和S1 bZIP可顯著激活報(bào)告基因GUS表達(dá)，突變相關(guān)基序后激活作用減弱。與野生型相比，bzip9突變體中RD29A和RD29B在ABA處理后的表達(dá)顯著降低，這些結(jié)果表明bZIP9通過(guò)與S1 bZIP異源二聚化參與ABA響應(yīng)調(diào)控。

圖4 bZIP9 介導(dǎo)脫落酸（ABA）響應(yīng)。

6.  bZIP53異源二聚體DNA結(jié)合特異性分析

為了系統(tǒng)地研究bZIP53異源二聚體對(duì)種子發(fā)育的作用，作者比較了bZIP53異源二聚體和同源二聚體的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)bZIP53異源二聚體特異性結(jié)合位點(diǎn)與種子成熟階段特異性表達(dá)的基因相關(guān)，表明其在種子成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。對(duì)bZIP53異源二聚體特異性結(jié)合位點(diǎn)的基序分析發(fā)現(xiàn)，其主要富集的基序包括含TGAC核心序列、ACGTG核心序列和TGACTCA序列的基序，這些基序與酵母bZIP GCN4的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。bZIP53與C bZIP共轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致PUMP1:GUS報(bào)告基因的表達(dá)顯著增加，而突變 TGAC 半位點(diǎn)（mut1）、ACGTG 元件（mut2）或同時(shí)突變兩者（mut1&2）會(huì)降低GUS表達(dá)。基于此，作者提出了bZIP53同源二聚體和異源二聚體的DNA結(jié)合特異性模型。

圖5 靶基因和基序差異揭示了bZIP53:bZIPC異源二聚體的特異性。

7. C/S1二聚體改變DNA結(jié)合特異性的一般模式

為了探究在bZIP53異源二聚體特異性結(jié)合中識(shí)別出的序列模式是否也適用于其他S1組bZIP轉(zhuǎn)錄因子，我們計(jì)算了通過(guò)比較S1:C異源二聚體的dDAP-seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的S1組同源二聚體的DAP-seq數(shù)據(jù)所獲得的異源二聚體特異性峰值與同源二聚體特異性峰值中這些模式的相對(duì)富集程度。研究發(fā)現(xiàn)，C/S1二聚體存在兩種基序富集模式。Type I中，同源二聚體偏好GCN4樣基序，異源二聚體偏好ACGTG元件；Type II中則相反。這表明盡管ACGTG元件在所有C/S1二聚體中均高度富集，但異源二聚體仍存在特異性結(jié)合，且這種特異性與酵母bZIP GCN4識(shí)別的序列元件相關(guān)。

圖6 bZIP C/S1二聚體的不同DNA結(jié)合特異性模式。

五、研究結(jié)論

dDAP-seq技術(shù)能夠在體內(nèi)基因組背景下繪制相互作用轉(zhuǎn)錄因子的全基因組結(jié)合位點(diǎn)，為研究轉(zhuǎn)錄因子相互作用如何調(diào)節(jié)結(jié)合特異性、潛在靶基因和生物學(xué)功能提供了有力工具。通過(guò)該技術(shù)對(duì)擬南芥bZIP C/S1二聚體的研究，揭示了異源二聚化對(duì)bZIP轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合偏好和功能特異性的重要影響，為深入理解植物基因表達(dá)的組合調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。未來(lái)，dDAP-seq技術(shù)可進(jìn)一步應(yīng)用于研究其他轉(zhuǎn)錄因子家族的異源二聚體，以及在不同物種中探究DNA結(jié)合特異性的進(jìn)化。