芍藥是一種傳統(tǒng)的中藥材，并且具有欣賞價(jià)值，其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常受到高溫脅迫的影響。褪黑素是一種內(nèi)源性微分子吲哚胺化合物，在各種生物體中具有多種生理功能，大量研究表明調(diào)節(jié)與褪黑素生物合成相關(guān)的基因來(lái)提高植物對(duì)高溫的耐受性。之前的研究中PlTDC被確定為P. lactiflora中褪黑素生物合成的關(guān)鍵基因。然而，關(guān)于內(nèi)源性褪黑素與P. lactiflora耐高溫之間的關(guān)系以及潛在的遺傳機(jī)制的更深入的研究尚未報(bào)道。

2022年5月19日，揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院陶俊和趙大球教授團(tuán)隊(duì)共同在Plant, Cell & Environment（IF=7.79）雜志上發(fā)表了題為“Herbaceous peony AP2/ERF transcription factor binds the promoter of the tryptophan decarboxylase gene to enhance high-temperature stress tolerance"的研究性論文。

在本研究中提到，PlTDC在P. lactiflora耐高溫脅迫中發(fā)揮了積極作用，并通過(guò)DNA pull-down技術(shù)鑒定了其表達(dá)受到AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子PlTOE3的激活，增強(qiáng)了褪黑激素的產(chǎn)生和高溫耐受性。這些結(jié)果為研究植物高溫脅迫的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。

圖1.芍藥中PlTDC和褪黑素含量的表達(dá)

1.PlTDC轉(zhuǎn)錄響應(yīng)高溫脅迫

為了分析PlTDC是否對(duì)高溫脅迫有響應(yīng)，首先通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了高溫脅迫下P. lactiflora葉片中PlTDC的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，高溫脅迫誘導(dǎo)PlTDC轉(zhuǎn)錄。

圖2.高溫脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)PlTDC的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草系的影響

2.煙草中PlTDC的異源過(guò)表達(dá)提高了煙草對(duì)高溫脅迫的抗性

為了證實(shí)PlTDC在調(diào)節(jié)煙草耐高溫性中的作用，在煙草中異種過(guò)表達(dá)PlTDC。將WT植株和轉(zhuǎn)基因株系在42°C下脅迫72 h。WT植株全部枯萎，而轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)正常。此外，DAB染色顯示轉(zhuǎn)基因株系中H2O2含量明顯低于WT植株。高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因品系的REC和MDA含量顯著低于WT植株，而Fv/Fm顯著高于WT植株。同時(shí)檢測(cè)相關(guān)保護(hù)酶基因的表達(dá)水平。Cu/ZnSOD、過(guò)氧化物酶基因(POD)和過(guò)氧化氫酶基因(CAT)，在高溫脅迫下在轉(zhuǎn)基因系中顯著高表達(dá)。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PlTDC可以通過(guò)增加褪黑素的產(chǎn)生來(lái)提高煙草對(duì)高溫脅迫的抵抗力。

圖3.高溫脅迫對(duì)野生型和PlTDC沉默型植物的影響

3.沉默PlTDC可增加P. lactiflora對(duì)高溫脅迫的敏感性

為了進(jìn)一步研究PlTDC在P. lactiflora耐高溫中的作用，利用VIGS技術(shù)抑制了P. lactiflora中PlTDC的轉(zhuǎn)錄。qRT - PCR結(jié)果顯示，PlTDC沉默植物的轉(zhuǎn)錄物水平僅為WT植物的21.56%，褪黑素含量也相應(yīng)降低。WT、pTRV2空載體轉(zhuǎn)化和PlTDC沉默的植株高溫脅迫，PlTDC沉默植株的生長(zhǎng)與對(duì)照相比受到明顯抑制。此外，與WT相比，PlTDC沉默植株的H2O2積累顯著， REC和MDA含量增加，F(xiàn)v/Fm和保護(hù)酶活性(SOD, POD和CAT)降低，在高溫脅迫下，這些指標(biāo)之間存在顯著差異。這些結(jié)果證實(shí)了PlTDC通過(guò)調(diào)節(jié)褪黑激素的產(chǎn)生參與P. lactiflora高溫應(yīng)激反應(yīng)的功能。

圖4.PlTOE3序列分析

圖5.PlTOE3激活了PlTDC的啟動(dòng)子活性

4.PlTOE3特異性激活PlTDC啟動(dòng)子

之后為確定上游調(diào)控區(qū)域?qū)Ω邷卣T導(dǎo)PlTDC表達(dá)的重要性，克隆了其上游2402bp的啟動(dòng)子片段，隨后，上游調(diào)控PlTDC的轉(zhuǎn)錄因子采用DNA pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選。DNA Pull Down使用特殊標(biāo)記的DNA探針作為誘餌，與提取的內(nèi)源細(xì)胞核蛋白進(jìn)行孵育，捕獲與DNA探針特異性結(jié)合的蛋白，最終使用蛋白質(zhì)譜的方法，鑒定出特異性結(jié)合的蛋白。結(jié)果顯示，僅獲得1個(gè)乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子(AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子。該轉(zhuǎn)錄因子接近擬南芥TOE3蛋白，聚集在A(yíng)P2亞家族中，之后將這個(gè)序列命名為PlTOE3。

為確定PlTOE3是否與PlTDC啟動(dòng)子特異性結(jié)合，進(jìn)行了酵母單雜交Y1H和熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)LRA進(jìn)行驗(yàn)證。Y1H實(shí)驗(yàn)表明，PlTOE3可以與PlTDC啟動(dòng)子相互作用。LAR證實(shí)，PlTOE3激活了煙葉中的PlTDC啟動(dòng)子。

圖6.PlTOE3的表達(dá)和亞細(xì)胞定位

5.PlTOE3轉(zhuǎn)錄對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)

為了分析PlTOE3是否也對(duì)高溫脅迫有響應(yīng)，檢測(cè)了高溫脅迫下葉片中PlTOE3的轉(zhuǎn)錄水平。PlTOE3的轉(zhuǎn)錄水平在P. lactiflora發(fā)育過(guò)程中隨著溫度的逐漸升高而升高，并隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這表明，PlTOE3與PlTDC具有相同的表達(dá)模式，意味著PlTOE3可能積極參與調(diào)控高溫抗性。此外，表達(dá)PlTOE3‐GFP融合蛋白的煙葉在細(xì)胞核中顯示出強(qiáng)烈的信號(hào)，表明PlTOE3是一個(gè)核定位蛋白，這與上述NLS序列的結(jié)果一致。

圖7.高溫脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)PlTOE3的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草系的影響。

圖8.高溫脅迫對(duì)野生型和PlTOE3沉默型植物的影響

6.PlTOE3正調(diào)控對(duì)高溫脅迫的抗性

將PlTOE3在煙草中過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系中煙葉NtTDC1的轉(zhuǎn)錄本水平比WT植株高17倍以上。在42°C高溫脅迫72 h后，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，與WT植株相比，ROS積累、REC和MDA含量顯著降低;相比之下，F(xiàn)v/Fm和保護(hù)酶基因(Cu/ZnSOD、POD和CAT)表達(dá)水平顯著升高。利用VIGS技術(shù)在P. lactiflora中沉默PlTOE3， PlTOE3和PlTDC的轉(zhuǎn)錄水平分別被抑制后，褪黑素含量、ROS、REC和MDA含量增加，F(xiàn)v/Fm和保護(hù)酶活性(SOD, POD和CAT)降低。上述結(jié)果與PlTDC轉(zhuǎn)基因結(jié)果一致，表明PlTOE3正調(diào)控了高溫脅迫抗性。

圖9.PlTOE3調(diào)控芍藥耐高溫脅迫的模型

小結(jié)

高溫誘導(dǎo)了PlTOE3的表達(dá)，這是一種核定位蛋白。這些結(jié)果與先前的研究一致。然而，很少有研究關(guān)注TOE3在高溫脅迫耐受中的作用;在本研究中證明了P. lactiflora中AP2/ ERF轉(zhuǎn)錄因子PlTOE3靶向PlTDC啟動(dòng)子，這是增加褪黑素產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。褪黑素不僅作為一種抗氧化劑直接消除活性氧還作為一個(gè)信號(hào)來(lái)激活SOD-CAT途徑消除ROS，最終增強(qiáng)P. lactiflora的高溫脅迫耐受性。

DNA Pull Down技術(shù)簡(jiǎn)介

DNA Pull Down是一種新穎的DNA-蛋白互作技術(shù)，能夠鑒定與特定DNA序列結(jié)合的蛋白（轉(zhuǎn)錄因子或者DNA結(jié)合蛋白）。DNA Pull Down使用特殊標(biāo)記的DNA探針作為誘餌，與提取的內(nèi)源細(xì)胞核蛋白進(jìn)行孵育，捕獲與DNA探針特異性結(jié)合的蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子），最終使用蛋白質(zhì)譜的方法，鑒定出特異性結(jié)合的蛋白。DNA Pull Down的優(yōu)勢(shì)在于，探針的設(shè)計(jì)長(zhǎng)度范圍廣，蛋白保持天然結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)周期短，通量高，特異性強(qiáng)，假陽(yáng)性率低，應(yīng)用范圍廣（適用于原核生物與真核生物）。將DNA Pull Down與蛋白質(zhì)譜結(jié)合，又具備高靈敏度的特點(diǎn)。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

探針長(zhǎng)度設(shè)計(jì)范圍廣

蛋白提取自新鮮組織和細(xì)胞，保持天然構(gòu)象

特異性強(qiáng)，假陽(yáng)性率低

適用于真核生物和原核生物

實(shí)驗(yàn)周期短，高通量，高靈敏度