DAP-seq新技術(shù)助力轉(zhuǎn)錄因子研究

DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)出現(xiàn)：

2016年5月，來(lái)自美國(guó)Salk研究所的科學(xué)家們?cè)贑ell期刊發(fā)表題為“Cistrome and Epicistrome Features Shape the Regulatory DNA Landscape”的文章（IF=28.71）。該研究開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)新技術(shù)：DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序），用于快速繪制轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶向DNA區(qū)域的圖譜：順?lè)唇M（cistrome）的蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的景觀圖。構(gòu)建完整的順?lè)唇M和表觀組圖譜（epicistrome maps）是闡明生長(zhǎng)發(fā)育、行為和疾病復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要方法。DAP-seq大大擴(kuò)展了科學(xué)家們收集的關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子及它們結(jié)合位點(diǎn)的信息。

DAP-Seq將蛋白質(zhì)體外表達(dá)技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，不需要針對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子制備特異性抗體，所以DAP-Seq具有快速、高通量、節(jié)約時(shí)間成本等顯著優(yōu)勢(shì)，比Chip-seq更易于擴(kuò)展；DAP-Seq方法可用于所有的植物，這為科學(xué)家提供了一扇窗口，了解調(diào)控序列中的遺傳或表觀遺傳變異影響它們性狀的機(jī)制。

本研究為了檢驗(yàn)DAP-Seq技術(shù)，科學(xué)家們快速繪制出了529種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合擬南芥基因組的位點(diǎn)。鑒別出了270萬(wàn)個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。隨后采用包含或不包含胞嘧啶甲基化的DNA重復(fù)了這些實(shí)驗(yàn)。該文測(cè)試的大約四分之三的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合模式發(fā)生了改變。這使得科學(xué)家們能夠揭示出如果不除去甲基化，或許會(huì)漏掉的結(jié)合位點(diǎn)。采用這些方法，可以看到只在一部分細(xì)胞或組織中活化的結(jié)合位點(diǎn)。該研究不僅闡明了調(diào)控蛋白改變基因表達(dá)的機(jī)制，還揭示了表觀遺傳甲基化標(biāo)記在這種調(diào)控中所起的作用。

Figure 1. Genome-wide TFBS （轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）Discovery by DAP-Seq

DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)完善

2017年 8月，同樣是 Salk研究所的科學(xué)家們，在Nature Protocols期刊發(fā)表題為“Mapping genome-wide TFBS using DAP-seq”的文章（IF=12.423）。詳細(xì)敘述了運(yùn)用DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)對(duì)全基因組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和整體流程。一個(gè)有分子生物學(xué)經(jīng)驗(yàn)的研究人員遵循這個(gè)方案，每周可處理多達(dá)400個(gè)樣本。

研究材料：5 μg genomic DNA，本文作者已采用DAP-seq技術(shù)，成功對(duì)擬南芥、玉米15號(hào)和人類（未發(fā)表）轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了檢測(cè)。

研究方法：DAP-seq

Figure 2. DAP-seq protocol overview

Figure 3. 擬南芥轉(zhuǎn)錄因子  TGA5 (AT5G06960) DAP-seq DNA 文庫(kù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)在中國(guó)的運(yùn)用

2019年8月21日，來(lái)自廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院董志誠(chéng)、寧麗華和江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙涵等，在Chinese Science Bulletin雜志發(fā)表題為“Mapping genome-wide of endosperm specific expression transcription factor O2 using DAP-Seq”的文章。利用DAP-Seq（DNA親和純化測(cè)序）技術(shù)，通過(guò)DNA建庫(kù)（NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific）），鑒定玉米胚乳特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子O2在全基因組水平上的結(jié)合位點(diǎn)。該研究共檢測(cè)到317個(gè)O2直接結(jié)合并調(diào)控的靶標(biāo)基因，包括97個(gè)已報(bào)道的ChIP-Seq檢測(cè)到的靶基因，以及220個(gè)DAP-Seq特異檢測(cè)到的靶基因。

研究材料：授粉后15 d的B73玉米胚乳。

研究方法：DAP-seq ：NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific）進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建；蛋白表達(dá)；DNA與蛋白結(jié)合以及Western-blotting檢測(cè)；測(cè)序并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

經(jīng)基序(motif)富集分析顯示，DAP-Seq檢測(cè)O2結(jié)合317靶標(biāo)基因與220個(gè)特異結(jié)合靶標(biāo)基因所富集的基序均與已報(bào)道O2結(jié)合motif相同。另外，GO富集分析顯示，與ChIP-Seq一致的O2靶基因主要參與zein蛋白合成及氨基酸代謝途徑，而特異檢測(cè)的O2靶標(biāo)基因，除參與上述途徑外，還主要參與糖代謝途徑以及多個(gè)脅迫響應(yīng)相關(guān)途徑。本研究利用DAP-Seq技術(shù)進(jìn)一步揭示了O2在胚乳發(fā)育過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用，該結(jié)果是對(duì)前人研究結(jié)果的驗(yàn)證和補(bǔ)充。